【学术交流】关于阿胶酶解物改善小鼠抗疲劳、增强免疫力功能的探索

关键词：阿胶酶解物；小鼠；抗疲劳；增强免疫力

阿胶( Asini Corii Colla) 为马科动物驴(Equus asinus L.)的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体胶,与人参、鹿茸并称为:滋补三宝[1], 始载于《神农本草经》, 被列为补血“圣药”[2]。阿胶味甘、性平,归肺、肝、肾经。具有补血滋阴、润燥、止血之功效, 被历代医家尊称为补血圣药。主治血虚萎黄,眩晕心悸,肌痿无力,心烦不眠, 虚风内动,肺燥咳嗽,痨咳咯血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏。近代医药工作者运用现代医学的观点和现代化技术手段，对其化学成分及有效物质基础、药理作用及其机理作用和质量标准等进行了多方面的探讨和研究, 并取得了显著的研究成果，近些年的研究也表明阿胶对机体免疫功能有正向调节作用[3-5]。但是，长期以来由于受技术条件和传统中药制药思想的限制，阿胶的很多功效作用还未得到足够的现代医学理论和实验的证实，特别是在调节机体免疫功能方面，相关的实验研究还少见报道。本研究拟通过观察阿胶酶解物对小鼠的细胞免疫的影响，探讨和分析阿胶酶解物对小鼠免疫功能的调节作用。

动物：SPF级健康ICR雌性小鼠，共96只，体重18.0～22.0g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供（生产许可证号：SCXK（京）2012-0001）。动物分为2个平行组，每个平行组48只。平行1组进行力竭游泳实验；平行2组进行迟发型变态反应和血清溶血素测定。每个平行组分为 4 个小组，分为对照组和3个剂量组，每个小组12只动物。

样品：阿胶酶解物，固体粉末，人体推荐剂量为2.1g/人.日，由东阿阿胶股份有限公司提供。

主要仪器与试剂：ML203/02型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、SHHW21/600A II型三用电热恒温水箱（天津市泰斯特仪器有限公司）、ST 16R型离心机（Thermo Fisher Scientific Inc.）、Varioskan Flash酶标仪（Thermo Fisher Scientific Inc.）、ADVIA2120型血液分析仪（Siemens Healthcare Diagnostics Inc.）、FACS Aria II型流式细胞仪（Becton, Dickinson and Company）、SW振荡水浴槽（优莱博技术(北京)有限公司）、显微镜（上海光学仪器厂）、数显游标卡尺（上海首丰精密仪器有限公司）。Yac- 1细胞购于山东省医学科学院。RPMI1640培养液购自美国Gibco公司，SRBC购自杭州四季青生物材料有限公司，丙二醛（MDA）测试盒（20161227）、脂质过氧化物（LPO）测试盒（20161227）、SOD试剂盒（20170118）均来自南京建成生物工程研究所，其他试剂均为分析纯。

剂量选择：阿胶酶解物组设0.18、0.35、1.05g /kg.bw组3个剂量组，分别为相当于人体推荐摄入量的5倍、10倍、30倍。以纯化水为溶剂将阿胶酶解物分别配至所需浓度，即称取0.36、0.70、2.10g阿胶酶解物以纯化水分别配至40mL。同时设立溶剂对照组，给予纯化水。各组动物按每日0.2ml/10g.bw连续灌胃30d后，测各项指标。

力竭游泳实验：小鼠腹腔注射乙酰苯肼、环磷酰胺后造模，给药结束后将大鼠放入冰水中游泳并计时，记录大鼠的力竭时间（以动物上下沉浮为限），随后对大鼠进行麻醉，腹主动脉采集EDTA抗凝血用于血液学检查，采集促凝血离心获得血清每组取雌雄各5只检测血清内SOD、MDA、LPO。

细胞免疫实验：迟发型变态反应(DTH)：实验结束前4d，小鼠腹腔注射2％（V/V）SRBC，致敏后4d测量左后足跖厚度，然后在测量部位皮下注射20％（V/V）SRBC，每鼠注射20μl， 24h后测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取均值。以攻击前后足跖厚度差值来表示DTH的程度。

体液免疫实验：血清溶血素水平测定：小鼠腹腔注射SRBC 5d后，摘眼球取血，离心取血清，稀释100倍，取稀释血清1ml与10％（V/V）SRBC 0.5ml、补体1ml（用SA液按1∶8稀释），混合，在37℃水浴中保温15-30min后，冰浴终止反应。离心，取上清液，在540nm波长处测定OD值。

数据处理：以Excel软件建立数据库，使用SPSS软件中Dunnett检验方法进行统计分析。

阿胶酶解物对小鼠力竭游泳的影响：大鼠体重明显低于对照组，体力耗竭所需时间也明显缩短，氧化产物MDA、LPO显著升高，提示模型建立成功。阿胶酶解物0.18g/kg、0.35g/kg、1.05g/kg能够明显增加大鼠耐力，延长体力耗竭所需时间，与对照组比较，低（0.18 g/kg）、中（0.35 g/kg）、高（1.05 g/kg）三个剂量组具有显著性差异 (172±37 vs 224±54, *P<0.05；172±37vs 230±55, **P<0.01；172±37 vs 243±33, ***P<0.001)，显著降低血清中MDA、LPO的含量，表明阿胶酶解物具有抗氧化、抗疲劳的作用。结果见图1。

图1.对小鼠力竭时间的影响。与对照组比较，低（0.18 g/kg）、中（0.35 g/kg）、高（1.05 g/kg）三个剂量组具有显著性差异 (172±37 vs 224±54, *P<0.05；172±37vs 230±55, **P<0.01；172±37 vs 243±33, ***P<0.001)

阿胶酶解物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响：阿胶酶解物低剂量组（0.18 g/kg.bw）小鼠足趾肿胀（DTH）与对照组比较无显著性差异；0.35和1.05 g/kg.bw剂量组动物的DTH与对照组比较有显著性差异(P< 0.01)（见图1）。实验结果表明阿胶酶解物对迟发型变态有明显的增强和促进作用,能够提高小鼠的细胞免疫功能。

 图2. 低（0.18 g/kg）、中（0.35 g/kg）、高（1.05 g/kg）三个剂量组小鼠的DHT与对照组比较，中高剂量组具有显著性差异(0.27±0.06 vs 34±0.07, **P < 0.01；0.27±0.06 vs 0.35±0.03, **P < 0.01)

阿胶酶解物对小鼠血清溶血素滴度的影响：对照组上清液多为血红色，模型组上清液几近无色，测定OD值显示，模型组OD值极其显著的低于对照组，提示模型组小鼠血清内抗体浓度显著低于对照组，免疫功能低下，模型建立成功。1.05g /kg.bw剂量组动物的半数溶血值（HC50）与对照组比较差异性特别显著 (P < 0.01)；0.18和0.35g/kg.bw剂量组动物的血清溶血素水平与对照组的差异均有显著性(P < 0.05)（见图1）, 实验结果表明阿胶酶解物能明显增加血清溶血素水平,对小鼠的体液免疫功能有增强作用。

大量的临床和动物实验都表明，阿胶具有补血、提高免疫力、舒缓血压等功效[7,8]。目前，大都基于全阿胶的药效学研究， 针对阿胶的药效物质基础研究非常少。众所周知，蛋白质需经消化液酶解为低聚肽或氨基酸而被机体吸收，发挥药效。考虑阿胶以胶原蛋白为主成分的属性，推断其蛋白经消化酶解产生的肽类成分是功效的重要因素[9]。1989年，李宗铎等[10]在《阿胶的药理作用》中通过动物试验证明了阿胶具有免疫促进作用。口服阿胶能够显著提高小鼠耐寒冷和抗疲劳的能力；口服阿胶还能使小鼠脾脏明显增重，但胸腺重量略有减轻，此外，口服阿胶可明显提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力。邓皖利，吴宏忠等[11-13]通过研究模拟人胃肠道消化过程，对阿胶酶解，对酶解后的阿胶按照分子量进行分离，获得了小分子活性补血组分A和B。分别通过体内和体外模拟途径，研究发现阿胶活性组分能够有效地保护骨髓造血微环境，骨髓组织的损伤，保护造血组织。刘元涛[14]等发现阿胶经酶解后所得低聚肽能显著增加胸腺和脾脏指数，表明阿胶经体外仿生酶解后对机体的非特异性免疫有增强作用。阿胶酶解物是利用酶解技术将阿胶中大分子蛋白质和多肽分解而成的小分子活性小肽，对阿胶的吸收有促进作用。抗体生成细胞检验（溶血空斑实验是体外检测单个抗体形成细胞B淋巴细胞的一种方法）和血清溶血数（半数溶血值，HC50）的测定常被用来检测体液免疫的功能状态。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判断细胞免疫功能结果测定结果阳性。通过小鼠连续给药后，测定其HC50可以定量地反映小鼠血清中溶血素抗体的生成量[15]。低中高剂量组小鼠半数溶血值明显高于对照组, 差异具有显著性。说明EPE明显提高实验小鼠体液免疫功能。小鼠迟发型变态反应试验和ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化（MTT）的测定常被用来检测细胞免疫的功能状态[16]。细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判断细胞细胞功能结果测定结果阳性[17]。通过小鼠连续给药后，测定其SRBC诱导足趾肿胀程度可以反映小鼠细胞免疫的功能状态。SMGN中高剂量组足趾肿胀程度明显高于对照组, 差异具有显著性。说明EPE明显提高实验小鼠对SRBC敏感性，由于SRBC是诱导细胞免疫的诱导剂，足趾肿胀程度的增加，进一步说明EPE通过增强机体的细胞免疫功能，而增加足趾的肿胀。通过力竭游泳实验、细胞免疫、体液免疫实验，发现阿胶酶解物具有延长力竭时间、增强小鼠迟发型变态反应能力、提高血清溶血素水平，以上结果表明阿胶酶解物对小鼠的抗疲劳和免疫功能有正向调节作用。本实验结果对阿胶的二次开发利用具有一定的参考价值。这一工作无论是对保护我国的重要中药资源、促进阿胶的现代化开发，还是进一步扩大这一宝贵资源的临床应用范围都有着十分重大的理论和现实意义。

供稿单位：东阿阿胶股份有限公司